ГОСТ 14746-69 Среда глюкозо-цитратно-желточная для хранения спермы быков при температуре 2-5 град. С

Цена 4
/У Р У б - ' М
f
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
СОЮЗА ССР
СРЕДА
ГЛЮКОЗО-ЦИТРАТНО-ЖЕЛТОЧНАЯ
ДЛЯ ХРАНЕНИЯ СПЕРМЫ БЫКОВ
ПРИ ТЕМПЕРАТУРЕ 2 -5 °С
ГО СТ 14746— 69
И здание о ф иц иально е
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СТАНДАРТОВ ,
СОВЕТА МИНИСТРОВ СССР
ïîæàðíûé ñåðòèôèêàò

УДК 6157 :619(06)74) Группа N 1
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ - СТАНДАРТ СОЮЗА ССР
СРЕДА ГЛЮКОЗО-ЦИТРАТНО-ЖЕЛТОЧНАЯ
ДЛЯ ХРАНЕНИЯ СПЕРМЫ БЫКОВ
ПРИ ТЕМПЕРАТУРЕ 2— 5 С
Medium, glucose-citratc-yolk. for keeping
of bull sperm at temperature 2—SC
ГОСТ
14746-69
Постановлением Комитета стандартов, мер и измерительных приборов при Со­
вете Министров С С С Р от 17/YI 1969 г. № 692 ером введения установлен
с 11 1970 г.
Несоблюдение стандарта преследуется по закону
Настоящий стандарт распространяется на синтетическую глю-
козо-цитратно-желточмую (ГЦЖ ) среду, предназначенную для
хранении спермы быков-произэодителей при температуре 2—5°С,
применяемой на станциях и пунктах искусственного осеменения.
1. ТЕХНИЧЕСКИЕ ТРЕБОВАНИЯ
1.1. Глюкозо-цитратно-жедточную среду готовят непосредствен­
но перед ее применением па станциях искусственного осеменения
в соответствии с Инструкцией по искусственному осеменению круп­
ного рогатого скота, утвержденной Министерством сельского хо­
зяйства СССР, и Ветеринарно-санитарными правилами работы
станции с пунктов искусственного осеменения, утвержденными
Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяй­
ства СССР.
1.2. В состав ГЦЖ среды зходят компоненты, указанные в
табл. 1.
Таблица 1
Навмеповавих хомпзяситов Ноомм
1. Глюкоза по ГОСТ 6038—51 нлв медицинская в г зд
2. Натрий лимоннокислый трехзамещеиный пятиводный по
ГОСТ 5.1314-72 в г
1.4
Издание официальное Перепечатка воспрещен»
Переиздание. Август 1973 г.
©Издательство стандартов, 1974.

С тр . 2 ГО С Т 1 4 7 4 & - *
Продолжение
Ниииеиояйвыя коипоиеито» Коомы
3. Желток куриного яйца в мл 10—2
4. Стрст-омишга сернокислый или солянокислый для внут­
римышечных инъекций л тыс. единиц
я
75-100
5. Пенициллин кристаллический (калиевая или натриевая
соль) для внутримышечных инъекций в тыс. единиц
75-100
6. Стрептоцид белый растворимый в г 0.12±0,02
7. Вода дистиллированная по ГОСТ 6709—72 в мл 100
*1.3. Глюкоза медицинская ч. д. а. или х. ч., антибиотики и бе­
лый растворимый стрептоцид должны отвечать требованиям Госу­
дарственной фармакопеи. Все препараты перед применением про­
веряют на безвредность для спермиев животных. Безвредность
антибиотиков определяют по ВТУ 117—67, утвержденным Главным
управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства
СССР, а глюкозы и цитрата — по эталонам этих препаратов, уста­
новленных Государственным научно-контрольным институтом ве­
теринарных препаратов.
1.4. Содержание влаги в глюкозе допускается не более 10%.
При приготовлении среды препарат берут в большем количест­
ве. чем указано в рецепте, с учетом содержания кристаллизацион­
ной воды.
Количество глюкозы (Я) в г вычисляют по формуле:
!де
у - 3-100 .
л - 100-й 9
3 — количество безводной глюкозы, требуемое рецептом;
б— содержание воды в препарате в процентах по анализу.
1.5. Желток куриных яиц берут от проверенных здоровых кур,
из яиц со сроком хранения при температуре 2— 5°С не более 7 су­
ток. Желательно брать желтки, окрашенные в ярко-оранжевый
цвет.

ГОСТ 1474*—* * Стр. 3
1.6. Среду готовят в день разбавления спермы. Компоненты,
входящие в состав среды, отзешнвают на аналитических весах.
Перед отвешиванием реактивов проверяют точность весов н
используют для нашескн часовое стекло, обработанное тампоном,
смоченным 96%-ным этиловым спиртом по 'ГОСТ 5962—67.
1.7. Для приготовления среды используют стерильные колбы и
мерные цилиндры по ГОСТ 1770—64.
Дистиллированную воду кипятят 15—20 мин и берут ее в необ­
ходимом объеме.
Глюкозу и цитрат, стерилизуют ультрафиолетовыми лучами в
бактерицидной камере (УНБК-1) в течение 16—20 ванн или в рас­
творе текучим паром при 100°С в течение 30 мин.
После охлаждения раствора до 80— 90°С в стерильных усло­
виях добавляют в него стрептоцид. Затем при температуре
58—60°С в раствор добавляют желток куриных яиц. Для этого
скорлупу яиц обеззараживают тампоном, смоченным 70%-ным
раствором этилового спирта, или ультрафиолетовыми лучами в
настольной бактерицидной камере в течение 10—-16 мин.
Яйцо раскалывают стерильным скальпелем, белок сливают в
чашку, а желток осторожно перекладывают на стерильный лист
фильтровальной бумаги, чтобы удалить остатки белка и оболочку
желтка. Желтки перекатывают к краю фильтровальной бумаги,
прокалывают оболочку и сливают их в стерильный цилиндр или
аенэурку.
Измеренное количество желтка вносят в колбу с раствором и
тщательно встряхивают до получения однородного цвета.
Затем при температуре не выше 45°С вносят антибиотики в
сухом виде или предварительно растворенными в 1—2 мл дистил­
лированной воды.
•1.8. Приготовленная ГЦ Ж среда по физико-химическим и био­
логическим свойствам должна отвечать требованиям и нормам,
указанным в табл. 2.
Таблиц* 2
Н«нм«но*анкя покиммлев Н о р к и
1. Внешний вид Однородная жидкость без
ков. осадка я механических
месей
ком-
при-
2. Цвет От светло-желтого до темно­
желтого
3. Запах Специфический

Стр. 4 ГОСТ 14746—49
Продолжении
Наижиомиия пзкдмтеясЯ
!
Моемы
4. Стерильность При посеве на пита тельные сре­
ды ие должно быть роста микроб­
ных тел в течение 10 суток
5. Безвредность Среда не должна вызывать по­
нижение активности, выживаемо­
сти и оплодотворяемости спсрми-
ев. Выживаемость н оплодогво-
ряемость сперм иев должна вы­
держивать испытание по пп. 10—
12 настоящей таблицы
6. Концентрация водородных ионов (pH) 6.9 ±0.2
7. Осмотическое давление при температу­
ре 0"С в атм
7.4±0,2
8. Температура среди перед разбавлени­
ем спермы в ч)
28—ЭО
9. Оптимальная степень разбавления
спермы
От 4 до 32 раз
10. Активность спермисв через 3 суток
хранения разбавленной спермы при темпе­
ратуре 2—5 Х в баллах
не ниже 7,0
II. Выживаемость спермнев до 1.0 балла
включительно з ч:
а) при температуре 2—59С 262
б) при температуре 38±0,5°С Л
12. Показатель абсолютной выживаемо­
сти спермисв (S) при температуре 2—б'С
1400

ГОСТ 1474*-«» Стр. 5
Продолжение
Нокмсаовакнх подавателе* Нерки
13. Оплодотворяскость здоровых коров в
одну охоту при осеменении их разбавлен­
ной спермой со срохом хранения не более
3 суток в %, не менее
60
2. МЕТОДЫ ИСПЫТАНИИ
2.1. Для контрольной проверки качества ГЦЖ среды, а также
соответствия ее требованиям настоящего стандарта должны при­
меняться правила отбора проб и методы испытаний, указанные
ниже.
2.2. Контрольная проверка ГЦЖ среды производится государ­
ственным контролером на предприятии-изготовнтеле (станция ис­
кусственного осеменения) или Государственным научно-контроль­
ным институтом ветеринарных препаратов Министерства сельского
хозяйства СССР.
2.3. Для контрольной проверки отбирают готовую среду
(100 мл) .или препараты тех партий (серий), из которых приго­
товлена среда (глюкоза — )100 г; натрий лимоннокислый трехзаме-
щенный пятиводный— flOO г; яйца куриные — б шт.; антибиотики —
по 5 флаконов).
2.4. Внешний вид, цвет и отсутствие механических примесей
устанавливают путем осмотра колбы со средой в проходящем све­
те при периодическом встряхивании.
2.5. Стерильность проверяют путем высева среды по 1 мл на
мясопептонный бульон (М П Б), 2%-ный мясопептонный агар МПА
с 1 % глюкозы и на мясопептонный печеночный бульон под вазе­
линовым маслом (среда Китт—Тароцци).
Наблюдают за посевами в течение 10 суток в соответствии с
методикой ветеринарко-санитарной оценки спермы и сред, утверж­
денной Главным управлением ветеринарии МСХ СССР.
2.6. Температуру среды 28— Ж С поддерживают в бактерицид­
ной камере (УНКБ-1) или в термостате.
2.7. Концентрацию водородных донов определяют с помощью
потенциометра ЛПУ-01 или другими приборами того же класса
точности.
Правильность показаний pH-метра проверяют по стандартным
буферным растворам, имеющим pH 1,68; 4,00; 6,88 и срок хране­
ния не более 3 месяцев при температуре 2— 5°С.
Подготовку' прбора к работе и определение pH среды прово­
дят по инструкции, прилагаемой к прибору.

Стр. 6 ГО СТ 14746-4*
2.8. Осмотическое давление среды определяют по разности тем­
пературы между точкой таяния льда (нулевая точка на термо­
метре) и точкой истинной кристаллизации. Исследование прово­
дят при помощи термометра Бекмана.
Перед началом работы каждый раз проводят калибровку тер­
мометра— установление нулевой точки. При этом термометр Бек­
мана помещают в мелкораздробленный тающий лед или снег и
наблюдают уровень р^тути и капилляре. Нели уровень ртути ока­
жется в нижней части шкалы или ниже делений шкалы термо­
метра, то добавляют ртуть из верхнего резервуара. Для этого
термометр перевертывают и нагревают рукой нижний резервуар
ртути до тех пор, пока ртуть капилляра не соединится с ртутным
столбиком верхнего резервуара. После этого термометр медленно
охлаждают до температуры 2—3°С, погрузив его на 7— 10 мин в
воду со льдом. Затем, держа термометр правой рукой за верхнюю
его треть, коротким но сильным ударом верхней части термо­
метра но большому или указательному пальцу левой руки отры­
вают излишнюю ртуть от ртутного столба верхнего резервуара.
Добиваются разрыва столбика ртути в месте соединения ка­
пилляра с верхним резервуаром. После этого ставят термометр в
мелкораздробленный лед и определяют уровень ртутного стол­
бика. Указанную манипуляцию повторяют до тех пор, пока верх­
ний мениск ртутного столбика в капилляре при температуре тая­
ния льда не будет стоять в верхней части шкалы между 3~5°С .
Определяют нулевую точку с точностью до 0,01°С и записы­
вают ее. Для исследования ГЦЖ среду каждый раз заливают в
объеме 4— 5 мл в чистую пробирку такого размера, чтобы ртут­
ный резервуар термометра был полностью погружен в жидкость
и не касался стенок и дна пробирки; для этого термометр фикси­
руют при помощи резинового кольца или корковой пробки.
Термометр с пробиркой помещают d другую пробирку такого
размера, чтобы между стенками пробирок оставалось простран­
ство в 2—3 мм. Подготовленный таким образом термометр пере­
носят в охлаждающую ванну. Исследуемую среду постоянно по­
мешивают петлевидной мешалкой, наблюдая при этом за пшгиже-
нием уровня ртути в капилляре. После переохлаждения выде­
ляется теплота кристаллизации и столбик трути поднимается до
истинной температуры замерзания ГЦЖ среды и некоторое время
остается на постоянном уровне. Эту точку отмечают и записывают
с точностью до Исследование повторяют. Для этого про­
бирку со средой отогревают в руке и определяют точку замерза­
ния.
Если после двух исследований расхождения не превышают
O.OIX, то проводят расчет осмотического давления. При расхож,
дении после повторного исследования более чем «а 0,оГС прозо-

ГОСТ 1Ш 6-М Стр. 7
дяг дополнительные исследования до получения необходимых
расчетных данных.
При исследовании растворов разной концентрации пробирку
и термометр после каждого исследования тщательно ополаски­
вают дистиллированной водой и просушивают.
Для охлаждения ванн применяют одну из указанных смесей:
а) смесь естественного льда с поваренной солью (3:1).
б) смесь спирта с сухим льдом;
в) спирт, охлажденный пропусканием через змеевик паров
жидкого азота или воздуха.
Температуру о ваннах в период работы поддерживают на
уровне минус 20—40°С.
Осмотическое давление вычисляют по депрессии — Д < ГЦЖ
среды, что представляет собой разность между нулевой точкой на
термометре и истинной температурой замерзания среды.
Пример:
Допустим, что пулевая точка на термометре Бекмана соответ­
ствует 4,46ПС. После трехкратного измерения истинная темпера­
тура замерзания раствора составляет: 3.79; 3,80; 3,81°С.
Среднее значение — 3.80°С.
Определяем /1 ■= 4.46 — 3,80 = 0,66.
По формуле Р0 * 12,04 -ДГ определяем осмотическое давление
среды при (гС:
Я0 «= 12,04 - 0.66 = 7.91.
Зная осмотическое давление раствора при 0°С, можно найти
его давление при любой температуре (Рп) в атм, исходя из зако­
нов Гей-Люссака:
Ту + т.
т*
где
То— температура абсолютного нуля (минус 273ЭС );
Тп — температура, при которой требуется определить осмо­
тическое давление жидкости, в °С;
Рп — определяемое осмотическое давление в атм.
Пример о п р е д е л е н и я осмотического давления ГЦЖ
среды при температуре 39*С (Рп) в атм:
273 + 39
273
•7.948 .0 5 .
2.9. Качество спермы по подвижности спермиеп определяют по
десятибалльной оценке, под микроскопом при температуре
40—42°С и увеличении микроскопа не менее чем в 120 раз.
Исследование спермы на протяжении первых 5—6 суток про­
водят через каждые 24— 48 ч, а при дальнейшем хранении спер­
м ы — черюз каждые 24 ч.

Стр. 8 ГОСТ 14746—М
Для создания на предметном столике микроскопа стабильной
температуры 40—42°С применяют термостаты для микроскопов
(ТМ-1 и др.), снабженные стандартными контактными термомет­
рами или нестандартными однотемпературиыми термометрами.
Для опенки на чистое предметное стекло наносят небольшую
каплю разбавленной спермы и 4—6 капель (2,8% ) изотонического
раствора лимоннокислого натрия. Капли раствора цитрата нано­
сят вокруг капли спермы на расстоянии 2—3 мм. После накры-
вання покровным стеклом капля разбавленной спермы оказы­
вается в центре, а раствор по краям.
Раствор цитрата должен выходить за пределы края покров­
ного стекла. Такое приготовление раздавленной капли предупреж­
дает преждевременное подсыхание капли спермы, создает хоро­
шую видимость спермнев в поле зрения микроскопа и способству­
ет правильной оценке спермы.
Результаты оценки спермы учитывают по форме приложения
х настоящему стандарту.
2.10 Для определения выживаемости спермнев в сперме, со­
храняемой при температуре 2—5°С, используют густую и среднюю
сперму с активностью не ниже 8.0 баллов.
Опыты повторяют 3—5 раз и используют один смешанный
эякулят спермы, полученный от одного, двух или трех быков-
производителеи.
Разбавленную сперму сохраняют в бытовом холодильнике или
пищевом термосе со льдом, температуру которых ежедневно про­
веряют максимальным термометром и записывают в журнал.
Оценку сохраняемой спермы по активности (количеству живых
спермнев) проводят з соответствии с п. 2.9. По окончании иссле­
дования спермы определяют выживаемость спермнев в часах и
общий показатель абсолютной выживаемости спермнев.
Выживаемость спермиев в часах определяют по оценке под­
вижности спермиев до 1,0 балла включительно плюс Vi времени,
прошедшего до следующего исследования.
Например, через 10 суток от начала хранения активность
спермы была установлена 1,0, а через 11 суток — единичная под­
вижность.
Следовательно, выживаемость спермиев — 252 ч.
Показатель абсолютной выживаемости (S) спермиев опреде­
ляют по формуле:
S ™ Oit% •*- Oiti + Йз/ j
..................н т . д.,
где
а,/,; и т. д. — показатели абсолютной выживаемости спер­
миев за отрезок времени;
с»; о2 и т. д. — количество живых спермиев в баллах;

ГОСТ 14746—69 Стр. 9
U tг; ts и т. д. — показатель времени, вычисляемый по фор­
муле:
где
Г — время, прошедшее от начала опыта до момента следую­
щего исследования (определяют для каждого дня нарастающим
итогом Тj + 7 * + Т 8 и т. д .);
п — порядковый номер исследования.
Пример заполнения формы учета оценки спермы по подвиж­
ности спер.миев приведен в таблице.
Примеры расчетов:
1. На 10.2.68:
/* =
Ту— Ту _ 120-48
2 2
- 3 6 ; '
a / - а«/« = 7 -3 6 =252.
2. На 16.2.68:
, Т „-Т , 252-216
/в
-----X-----=------к------
at = Oett - 1 -.18 = 18.
Выживаемость спермиев в часах равна 252.
Uо = 264 — 12 ч, г. е. '/з времени, прошедшего от предпоследне­
го до последнего исследования.
Полученные результаты по выживаемости спермиев з разных
опытах обрабатывают биометрическим методом.
2.11. Для определения выживаемости спермиев, сохраняемых
при температуре 38°С, пробы с разбавленной спермой ставят в
термостат, который должен быть проверен за 3—5 дней до опыта
на поддержание стабильной температуры.
Сперму, сохраняемую при 38X1,' оценивают через каждые
' 1—4 ч. Оценку спермы и учет результатов исследования проводят
по пп. 2.9. и 2.10.
2.12. Для определения оптимальной степени разбавления спер*
мы заготавливают 7 стерильных флаконов, закрытых корковыми
или резиновыми пробками, обернутыми пергаментной бумагой.
В первый флакон наливают 7 мл ГЦЖ среды, а в остальные
6 флаконов — по 4 мл.
Затем во флакон .V? 1 при температуре среды 28 -30°С добав­
ляют 1 мл свежеполученной спермы быка с оценкой не ниже
С—8,0.
Флакон с разбавленной спермой тщательно перемешивают.
При помощи стеклянной пипетки переносят 4 мл разбавленной
спермы во флакон № 2 и получают разбавление в 16 раз.

Стр. 10 ГОСТ 1474* —69
а
£
С*
|
R
Б
rO
Q =
S g Щ g £ 8 И 2 S
+г
Ь 2a> О» «О <X) <D 1Л -у C4 ^
4i
<4
b г»
u>
ж о ci « © о 2 »i M 2 1
— 5 3 8 n « 5 - ^ “
сч
a *
Б
о я г- о » о id я -
V
-
p*Si
2Ц1
T . n 5
8 3 ^
4 l l
Hi-
;S e
«-*СО CD Ж, JN 4> Q £$ «0 00 I
£ СЧ 8 Й « ®^чт-|
«
- >4
« M S R
;gS | ^ o
3c*2«
* *se
Ф
О) О»00 l> Ю W W -* с
«3
—
I 7
ip ь4
||8 ,
с -
«Л2 « 8 8 Я S 2 1
i l M P r
-
° 35 5 8 8 S g S S S
— - - Cl П Cl
B illie
! e i l s
CO
— OI О V й ® N И С1 о
55
|з
s r
q «
«
i s 1
I I i
s : i ' ! 2 2 ! 2
”1 ф "I “! (N fi и ci ci ci ci N
СЧ»; S f i N C I j^ J f jx r t ■* |Д IO N
Я “ «8
о a 2
со
о
1—
о
н
5
1 -
-
— « r t ^ й # I - ° 0 О О - о .
Примечание. В графе 3 порядковые цифры по вертикали I; 2; 3 я т. д. указывают на Га Г,; Г»нт.д.
i; ta л т. д., а,; о,; а, и т. д., а также atlt; atta; a,h и т. д.

ГОСТ 1474*—49 Стр. !1
Из флакона № 2 также переносят 4 мл разбавленной спермы
флакон М» 3 я т. д. до флакона Л6 7.
Из флакона N? 7, после тщательного перемешивания, 4 мл раз­
бавленной спермы выбрасывают.
В результате последовательного разбавления спермы получают
разведения 1:8; I :il6; 1 :32; 1:64; 1 : 128; 1 :266; 1:612.
>ГЦЖ среду проверяют не менее трех раз.
Для этого готовят 3 ряда по 7 пробирок с вышеуказанными
разведениями. В каждом ряду пробирок применяют сперму од­
ного эякулята. Таким образом, при трех повторностях получают
21 флакон разбавленной спермы от одного и того же объема
спермы.
Флаконы с пробами разбавленной спермы ставят на хране­
ние при температуре 2—б^С. Оценку спермы и учет результатов
исследования проводят по пп. 2.9 и 2.10.
Оптимальную степень разбавления спермы определяют по наи­
большему показателю абсолютной выживаемости спермисв.
При этом учитывают, что а дозе должно содержаться не ме­
нее 40 млн. живых спермиев. При определении оптимальной сте­
пени разбавления спермы можно одновременно учитывать каче­
ство среды по п. 2.10.
2.13. Для определения процента оплодотворяемости животных
в одну охоту после осеменения их разбавленной сохраненной
спермой используют здоровых проверенных ректально и ваги-
нально коров в возрасте до 5 лет. имевших 2—3 нормальных
отела. Для эти х целей можно использовать и телок случного воз­
раста, отвечающих по своему развитию, весу и упитанности тре­
бованиям, предъявляемым к данной породе.
В опыте по установлению оплодотворяемости должно быть не
менее 20 животных. Учет результатов осеменения проводят пред­
варительно через 3 месяца по определению беременности методом
ректального исследования, а конечный — по отелам.
S. ХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ
3.1. ГЦЖ среду хранят и транспортируют в склянках по
ГОСТ 1770—64 при соблюдении стерильности и температуры
2— 5°С и течение 24 ч.
Замена
ГОСТ 5.1314-72 введен гэаксн ГОСТ 8161—67.

Форма учета результатов микроскопической оценки
Стр. 12
2
Ы
К
я
X
с
л
и
1
1
С
Л
5
о
<5
Q '
-
215
i|i
lia* я
||з
S3Se
S"
а Л
№ •
I , i
Щ 1
1*5 г
! ! * -
с
с*
г
*
52S" “гВг
s ls llli8
!=к
I1
|с||а
1Ч Н в
С i
1L
=Й
s r
ч«
. 6
* 8
1
=« *
2 * 2 2 2 *
СЧ ►; СЙ ей ей я
(о в К оо oi к;
Я Л
чо а
О .
Jc
в — от ее к?

Редактор В. Г. Сазонова
Технический редактор Г. И. Неверова
Корректор Э. В. Митяй
С л а н о в идб. |ЯИ 1973 г. Пода. в печ 5/11 1874 г. 0.75 и. я. Тив. 2000
Изхотслгстао станхаотов. Москва- Д-23 НовопвкяевскяВ пев., д. 3.
Вильнюсская txuoi рафия Издательства стандартов, уд. Мивдауго. 12/14. Зах. 4 9»
ÃÎÑÒ 14746-69